1.  引言

高濃度制劑是指最終的單抗蛋白濃度大于100 mg/mL的制劑狀況。目前不難發現，F(xiàn)DA批準的單抗產(chǎn)品中有大約三分之一是高濃度制劑（＞100mg/mL）。^[1]高濃度制劑可降低西林瓶的灌裝體積要素配置改革，節(jié)約生產(chǎn)成本，減少注射時間溝通機製，提高患者依從性無障礙。

注射劑中的顆粒檢測是注射劑質(zhì)量控制的重要項目，影響著注射劑的安全性及有效性宣講活動。顆粒主要包括可見顆粒和亞可見顆粒（sub-visible particle高產，SbvP），美國藥典USP<788>和中國藥典CP0903中均對注射劑亞可見顆粒（不溶性微粒）的檢測方法和限度進行了明確的規(guī)定快速融入。針對抗體注射劑帶動產業發展，美國藥典USP<787>和USP<1787>對其亞可見微粒進行了補充說明。

與常規(guī)注射劑相比發揮作用，高濃度抗體藥物制劑具有注射體積?。ㄍǔ?mL）^[2]等特點，現(xiàn)有檢測方法在檢測小容量的單劑量包裝樣品具有一定的局限性十分落實；高濃度抗體藥物制劑的理化性質(zhì)相較于常規(guī)注射液也出現(xiàn)了變化規模，蛋白質(zhì)濃度的增加使短距離相互作用的影響越來越大，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用變得顯著作用，增加了制劑的黏度。黏度、流動性差等特點使其在亞微粒檢測混合和抽取時有一定影響銘記囑托；由于高濃度抗體制劑的分子間結構更加復雜事關全面，更易產(chǎn)生自締合（Self- association）和聚集（Aggregation），相較于常規(guī)SbvP檢測的光阻法充分發揮，流動成像法因可區(qū)分某些類型的顆粒而廣泛應用于聚集體的檢測積極性。

2.  顆粒粒徑/計數(shù)技術

高濃度抗體藥物制劑的顆粒來源主要有三類：

1）外源性顆粒，指與生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品成分無關的顆粒解決；

2）內(nèi)源性顆粒性能，來源于生產(chǎn)原料、包材以及生產(chǎn)工藝的操作中所產(chǎn)生的亞可見微粒不斷豐富，如膠塞上脫落的碎片方案、預充針的硅油涂層和玻璃碎片等多種方式；

3）固有性顆粒，即產(chǎn)品自身產(chǎn)生的顆粒實施體系，如蛋白聚集與表面活性劑膠束形成的顆粒臺上與臺下。

由于存在多種潛在的顆粒來源，因此識別顆粒并確定顆粒來源有利于產(chǎn)品開發(fā)和應用評估技術創新。如果研發(fā)時測試結果與標準限度出現(xiàn)偏差效高性，顆粒識別將指導原因分析、風險評估技術發展、糾正措施重要的作用、調(diào)整控制策略等多個環(huán)節(jié)。^[3]

美國藥典推薦使用光阻法作為檢測抗體注射劑中不溶性微粒的檢測的方案[4],相較于常規(guī)的注射劑自動化，高濃度抗體注射劑在使用光阻法需注意：

1）粒度分布的分析取決于所使用的儀器及其校準方法重要的意義，目前常用于校準的標準粒子均為球體，但蛋白質(zhì)顆粒通常具有不規(guī)則的形態(tài)規模最大，等效球體模型下可能會對蛋白質(zhì)粒徑檢測有一定的影響關註度。

2）小體積檢測分析方法開發(fā) 高濃度抗體注射劑具有注射體積小的特點，無法直接用于常規(guī)儀器的檢測重要手段，需將幾個樣品混合獲得可供測試的樣品穩中求進，美國藥典USP<788>規(guī)定需混合得到25ml的樣品，每次取樣5mL,共檢測4次不折不扣，統(tǒng)計≥10μm 和≥25μm的顆粒濃度再獲，舍去第1次測定結果，取剩下3次測定結果平均值為最終結果成效與經驗。

此外美國藥典USP<787>中專門針對治療性蛋白質(zhì)注射劑和相關制劑進行了補充說明，允許使用較小的測試產(chǎn)品體積來進行不溶性微粒的檢測健康發展。對于沒有足夠體積的產(chǎn)品提供了有力支撐，可將適當數(shù)量的產(chǎn)品混合在一個單獨的容器中，以獲得單次測試所需的體積(通常為0.2-5.0 mL)活動。AccuSizer A2000 系列儀器可以提供小體積檢測方案，以下檢測方案僅供參考：

通過與常規(guī)檢測方法的對比保障性，我們建議在小體積檢測分析方法開發(fā)上可進行如下改進：①使用微升級別進樣量不斷進步、降低流速；②使用小體積注射器領先水平，保證體積精度認為；③重新校準曲線保證數(shù)據(jù)精確度。

3）大多數(shù)高濃度抗體藥物需冷藏儲存，如采用較低溫度直接檢測良好，與管路中殘留不同溫度液體間將發(fā)生熱量傳遞雙重提升，造成液流紊亂；

4）中美藥典均為≥10μm和≥25μm的顆粒制定了明確的標準限度倍增效應，對于分子量較大的蛋白質(zhì)藥物結果，分子聚集之后產(chǎn)生的顆粒在免疫學方面存在隱患。Carpenter等人認為0.1-10μm 范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)不溶性微粒潛在免疫原性風險存在不確定性重要意義，測量<10 μm尺寸范圍內(nèi)的不溶性微粒物有助于產(chǎn)品開發(fā)和表征規則製定。^[5]

3.  現(xiàn)行光阻法的優(yōu)化方案

儀器優(yōu)化設計^[6]：光阻法顆粒計數(shù)儀器可通過儀器設計滿足不同的應用目的。

1）如果在檢測器流通池不變的基礎上減少測樣體積單產提升，可通過如下方式：

• 取樣針的內(nèi)徑變小

• 取樣針的長度變短

• 減少取樣針尖與測樣容器底的距離

• 取樣針為平頭型設計

• 軟件中支持設置不同取樣體積求索，即包括最滴取樣體積

• 支持基于取樣針中心點的平底容器的傾斜放置樣品固定模塊

2）如果要減少測樣過程中氣泡的產(chǎn)生，設計如下

• 可調(diào)節(jié)抽取樣品速度

• 平頭取樣針

• 測樣流通池孔徑小于取樣針的內(nèi)徑

AccuSizer A2000 系列不溶性微粒檢測儀多樣性，采用PFA材質(zhì)進樣管性能穩定，進樣管管內(nèi)內(nèi)徑可選，長度可調(diào)規模，可使用平頭取樣針數字化，可用于不同規(guī)格的試劑瓶，軟件可以調(diào)節(jié)不同的進樣體積作用，近透明的材質(zhì)更方便觀察是否抽取到氣泡開展攻關合作。

A2000 系列單個傳感器檢測范圍為：0.5μm~400μm，傳感器濃度上限10000個/mL，具有512數(shù)據(jù)通道組建，分辨率高。模塊化設計結構，維護升級便利深入交流研討，如樣品檢測量多，可選配自動進樣器效果較好，可實現(xiàn)全自動進樣集聚效應。

圖1 AccuSizer A2000 系列不溶性微粒檢測儀

4.  新型SbvP檢測方法

不溶性微粒的來源有多種，分辨微粒的來源有利于開發(fā)和應用的控制策略廣泛應用，但常規(guī)SbvP檢測的光阻法無法辨別不溶性微粒的形態(tài)提升，無法確定微粒的來源。2017年USP40<1788>收錄不溶性微粒檢測第三法——流動成像法（Flow Imaging method, FIM）情況，流動成像法結合微流體和光學顯微鏡技術，可快速大量地自動捕捉圖像，這些圖像可以用來分析生物治療樣品中顆粒的濃度等多個領域、大小分布及形態(tài)等形式。

聚集蛋白具有半透明防控、折光率低等特點，在使用光阻法（Light Obscuration method, LO）進行不溶性微粒測試時的特點，可能無法檢測出透明度較高高質量、對光不敏感的蛋白粒子。對于聚集蛋白適應性，流動成像法獲得的粒子濃度將比光阻法獲得的粒子濃度更準確^[7]迎難而上。但光阻法仍然是評估顆粒負荷的一個重要工具，因為：

1. 光阻法儀器具有高可靠性和可重復性激發創作；

2. 對非美國市場的監(jiān)管要求可能需要使用光阻法更高效；

3. 藥品的光阻法測試有悠久的歷史和重要的積累的經(jīng)驗，測量的顆粒濃度的歷史值很容易與當代的光阻法測量值進行比較探索。

綜上所述，采用光阻法為主，流動成像法為輔的不溶性微粒檢測方法更有利于產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量監(jiān)控重要作用。

FlowCam8000系列流式成像顆粒分析系統(tǒng)

流式成像顆粒分析系統(tǒng)（FIM）將數(shù)字成像堅持先行、流式細胞技術和顯微鏡的優(yōu)勢結合在單個解決方案中。除了測量傳統(tǒng)的粒子大小和數(shù)量增幅最大，通過分析圖像還可以表征生物藥品具體而言、蛋白樣品、注射液系統、細胞十分落實、浮游微生物等中的亞可見顆粒（不溶性微粒）。

圖2 FlowCam 8000 流式成像顆粒分析系統(tǒng)

5. 在藥品全生命周期中對SbvP進行監(jiān)管

早期研發(fā)階段和后期工藝階段可使用多種檢測方法對顆粒進行全面的表征分析逐步顯現，對比不同方法間差異性作用，監(jiān)控顆粒的形成途徑，來源及變化趨勢近年來，為處方工藝開發(fā)提供參考銘記囑托；

后期研發(fā)階段的重點是了解產(chǎn)品不同批次之間的可比性，以及顆粒結果與配方形式、制造和使用等因素之間的關聯(lián)性擴大，如應監(jiān)測臨床批次1~100 μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)量與大蟹浅Ｍ晟?鬟f；應收集在儲存、使用和壓力條件下形成的不溶性微粒物的定量和定性數(shù)據(jù)不斷完善，并制定風險控制策略發揮效力；在最終選擇監(jiān)測產(chǎn)品顆粒大小和計數(shù)的方法時，應分別建立內(nèi)源性顆粒勞動精神、外源性顆粒及固有性顆粒的控制策略穩定發展。

藥典的監(jiān)控標準是最滴標準方便，與對微粒危害的認識和監(jiān)測需求相比具有滯后性，因此更好，在內(nèi)控時也應嘗試從多種粒徑水平基石之一、多種檢測方法對顆粒進行全面表征和分析，積累數(shù)據(jù)安全鏈，以便為增加放行方法和提升放行要求提供依據(jù)行業分類，也為不良反應原因回溯提供數(shù)據(jù)支持。^[8]如下是SbvP在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的檢測策略增持能力，供參考應用領域。

表1 SbvP在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的檢測策略^[6]

參考資料

[1] 淺析高濃度制劑開發(fā)面臨的挑戰(zhàn)和解決方案 || 抗體藥研發(fā)問答，抗體君（公眾號）

[2] BADKAR AV提高鍛煉，GANDHI RB統籌推進，DAVIS SP，et al．Subcutaneous delivery of high-dose /volume biologics: current status and prospect for future advancements［J］．Drug Des Devel Ther進行培訓，2021科普活動，15: 159-170

[3] USP 1787

[4] USP 787

[5] Satish K Singh, Nataliya Afonina, Michel Awwad, et al. An Industry Perspective on the Monitoring of Subvisible Particles as a Quality Attribute for Protein Therapeutics[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，2010各方面，99（8）： 3302-3321.

[6] 丁毅,張雅婷,郭歡歡,熊菲,紀仁智,邱波.高濃度抗體藥物制劑的亞可見顆粒檢測方法優(yōu)化和操作策略[J].中國新藥雜志,2022,31(08):762-766

[7] USP 1788

[8] 郭莎,賈哲,吳昊,王蘭.單克隆抗體顆粒表征的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)[J].中國藥事,2022,36(02):161-169.